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Escolhendo o alvo ideal

Introdução

A nossa tecnologia conhecida como ERA, Enzymatic Recombinase Amplification, é uma processo inovador de amplificação isotérmica de ácidos nucleicos, projetada para diagnósticos moleculares rápidos, precisos e de alta sensibilidade. Desenvolvida como um aprimoramento dos métodos de amplificação isotérmica, a Tecnologia ERA oferece vantagens significativas em termos de simplicidade operacional, resistência a inibidores, e maior especificidade e sensibilidade em comparação com testes rápidos tradicionais e qPCR. Essas características tornam a ERA especialmente útil em contextos de recursos limitados, como pontos de cuidado (POCT) e comunidades rurais, onde diagnósticos rápidos e precisos são cruciais.

Como escolher os alvos?

A tecnologia ERA é capaz de detectar uma ampla gama de alvos genéticos, incluindo vírus, bactérias e mutações genéticas associadas a doenças, como o câncer. Um dos principais benefícios da ERA é sua resistência a inibidores que comumente afetam outras técnicas de amplificação, o que possibilita a detecção precisa mesmo em amostras complexas. Além disso, a ERA utiliza protocolos mais simples e rápidos, facilitando a implementação em ambientes com recursos limitados. Em comparação com testes rápidos e qPCR, a ERA proporciona maior especificidade e sensibilidade, o que resulta em diagnósticos mais confiáveis. A detecção dos alvos é realizada por diferentes métodos de leitura, como fluorescência, tiras de fluxo lateral (Lateral Flow Assay – LFA) e plataformas CRISPR-Cas, cada um exigindo sondas específicas para garantir a clareza dos resultados.

Desenhando Primers e Sondas para ERA

Passo a Passo para escolha dos alvos , desenho dos primers e sondas

1. Escolha dos Alvos

Passo 1: Identificação do Patógeno

Identificar o patógeno ou o gene de interesse que você deseja detectar.

  • Ferramentas: Bases de dados genômicas (como NCBI, Ensembl) para acessar as sequências genômicas completas do patógeno.

Passo 2: Análise de Conservação Genômica

Selecionar regiões conservadas no genoma do patógeno que sejam essenciais para sua sobrevivência e menos propensas a mutações.

  • Ferramentas: Softwares de alinhamento de múltiplas sequências (como Clustal Omega ou MUSCLE) para comparar diferentes cepas ou variantes do patógeno e identificar regiões conservadas.

Passo 3: Evitar Regiões Variáveis

Evitar regiões com alta variabilidade genética, como áreas sujeitas a mutações frequentes.

  • Ferramentas: Análise de variação genética utilizando bases de dados como dbSNP ou ferramentas de bioinformática específicas para identificar hotspots de mutação.

Passo 4: Confirmação de Acessibilidade

Garantir que a região escolhida seja acessível para a hibridização de primers e sondas, sem formar estruturas secundárias complexas.

  • Ferramentas: Softwares de predição de estrutura secundária de RNA/DNA (como mFold) para prever estruturas que possam interferir na hibridização.

2. Desenho dos Primers

Passo 1: Seleção da Região-Alvo

Usar a região conservada identificada na etapa anterior como a sequência-alvo para os primers. A região a ser amplificada por ERA geralmente é curta, variando entre 80 a 200 pares de bases (bp). Essa faixa de tamanho é escolhida para garantir que a amplificação seja rápida e eficiente em condições isotérmicas, maximizando a sensibilidade do teste. A eficiência da amplificação em ERA é melhor quando a região-alvo está dentro desse intervalo, permitindo uma detecção mais rápida e precisa.

  • Ferramentas: Utilização da sequência-alvo diretamente em softwares de design de primers.

Passo 2: Definição dos Parâmetros dos Primers

Definir os parâmetros ideais para os primers:

    • Comprimento: 30-35 nucleotídeos.
    • Conteúdo GC: 40%-60%.
    • Temperatura de fusão (Tm): 50°C-60°C.
    • Evitar formação de dímeros de primers e estruturas secundárias.
  • Ferramentas: Primer3 ou ferramentas semelhantes para desenhar primers com os parâmetros ideais.

Passo 3: Verificação de Especificidade

Garantir que os primers se liguem exclusivamente ao alvo desejado.

  • Ferramentas: BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) para verificar a especificidade dos primers contra o genoma completo do patógeno e outros organismos potenciais que possam estar presentes na amostra.

Passo 4: Ajuste Final e Síntese

Fazer ajustes finais nos primers se necessário, como adicionar “caudas” ou modificar nucleotídeos para melhorar a eficiência.

3. Desenho das Sondas

Passo 1: Seleção do Tipo de Sonda

Escolher o tipo de sonda com base no método de leitura do teste (Fluorescência, Lateral Flow Assay – LFA, CRISPR-Cas). 

  • Ferramentas: Seleção baseada nas necessidades específicas do teste (por exemplo, fluorescência requer sondas FRET, LFA requer sondas com marcas visuais como ouro coloidal).

Passo 2: Desenho da Sonda

Criar sondas que se liguem especificamente à região entre os primers, sem sobreposição significativa com eles. As sondas utilizadas em ERA geralmente têm entre 20 a 30 nucleotídeos. O tamanho específico da sonda pode variar dependendo do método de detecção (como fluorescência ou Lateral Flow Assay), mas elas são desenhadas para serem suficientemente longas para garantir a especificidade, mas curtas o suficiente para hibridizar eficientemente ao DNA-alvo. A sonda deve ser localizada próxima aos primers, mas geralmente há uma distância de 10 a 30 nucleotídeos entre o final do primer e o início da sonda. Essa distância deve ser suficiente para evitar a interferência entre a hibridização dos primers e a sonda, mas curta o bastante para garantir uma amplificação eficiente e uma detecção precisa.

  • Ferramentas: Softwares de design de sondas específicos para o método de detecção (como Beacon Designer para sondas fluorescentes).

Passo 3: Marcação da Sonda

Adicionar marcadores (fluoróforos, biotina, etc.) às sondas, conforme necessário para a detecção.

Passo 4: Verificação e Ajustes

Verificar se a sonda não forma estruturas secundárias e se tem uma ligação forte e específica ao alvo.

  • Ferramentas: mFold ou softwares equivalentes para prever a formação de estruturas secundárias.

Passo 5: Teste Piloto

Realizar um teste piloto para validar o desempenho da sonda em condições de laboratório antes da aplicação em larga escala.

  • Ação: Ajustar a sequência ou concentração da sonda conforme necessário com base nos resultados do teste piloto.

Este passo a passo garante que o processo de escolha dos alvos, design dos primers e design das sondas seja metódico e baseado nas melhores práticas, resultando em testes ERA altamente eficazes e confiáveis.

As sondas e primers podem ser adquiridas conosco, entre em contato.

Referências

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  3. Rani, A., Ravindran, V. B., Surapaneni, A., et al. (2021). Evaluation and comparison of recombinase polymerase amplification coupled with lateral-flow bioassay for Escherichia coli O157

     

    detection using different genes. Scientific Reports, 11, 1881. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81312-6

  4. Lobato, I. M., & O’Sullivan, C. K. (2018). Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry, 98, 19-35. https://doi.org/10.1016/j.trac.2017.10.015

  5. Torii, S., Furumai, H., & Katayama, H. (2022). Recovery and detection of viruses from sewage using polyethylene glycol precipitation and ultrafiltration. Water Research, 125, 305-312. https://doi.org/10.1016/j.watres.2022.125307